在懸浮細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞、腫瘤懸浮細(xì)胞、CHO 工程細(xì)胞）的體外培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)研究中，死細(xì)胞的積累是常見(jiàn)問(wèn)題。死細(xì)胞會(huì)釋放核酸酶、蛋白酶等有害物質(zhì)，破壞培養(yǎng)基成分、引發(fā)活細(xì)胞凋亡，同時(shí)其碎片會(huì)干擾流式檢測(cè)、細(xì)胞分選、蛋白純化等后續(xù)實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差或?qū)嶒?yàn)失敗。因此，高效、溫和地去除懸浮細(xì)胞中的死細(xì)胞，是保障細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。目前主流去除技術(shù)基于 “活細(xì)胞與死細(xì)胞的物理特性差異（密度、大小、沉降速率）” 或 “分子標(biāo)志物差異” 設(shè)計(jì)，需根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型、樣本量及實(shí)驗(yàn)需求選擇適配方案。

一、基于物理特性的死細(xì)胞去除技術(shù)：溫和高效的常規(guī)選擇

懸浮細(xì)胞中活細(xì)胞與死細(xì)胞的物理特性差異（如密度、體積、變形能力）是物理去除方法的核心依據(jù)，這類(lèi)技術(shù)操作簡(jiǎn)便、對(duì)細(xì)胞損傷小，適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室場(chǎng)景。

1. 密度梯度離心法：基于密度差異的精準(zhǔn)分層

密度梯度離心是最常用的方法之一，其原理是利用梯度介質(zhì)（如 Ficoll-Paque、Percoll、OptiPrep）構(gòu)建連續(xù)或不連續(xù)密度梯度，通過(guò)離心力使活細(xì)胞與死細(xì)胞因密度不同在梯度中處于不同分層，從而實(shí)現(xiàn)分離。

操作要點(diǎn)：需根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞密度選擇梯度介質(zhì) —— 例如分離人外周血淋巴細(xì)胞時(shí)，常用密度 1.077g/mL 的 Ficoll-Paque 溶液，活淋巴細(xì)胞密度略低于該值，會(huì)浮于梯度液上層，而死細(xì)胞、紅細(xì)胞密度更高，沉于梯度液下層或管底；培養(yǎng)的腫瘤懸浮細(xì)胞（如 Jurkat 細(xì)胞、K562 細(xì)胞）密度通常為 1.050-1.060g/mL，可選用 Percoll（可自主調(diào)節(jié)密度）構(gòu)建 1.040-1.070g/mL 的不連續(xù)梯度，通過(guò) 300-400×g 離心 15-20 分鐘（室溫或 4℃，避免高溫?fù)p傷細(xì)胞），活細(xì)胞會(huì)富集于 1.050-1.060g/mL 的界面層。

優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是回收率高（活細(xì)胞回收率可達(dá) 80%-90%）、純度高（死細(xì)胞去除率＞95%），且梯度介質(zhì)（如 Percoll）滲透壓與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境接近，對(duì)活細(xì)胞損傷小；缺點(diǎn)是需優(yōu)化梯度密度與離心參數(shù)，操作時(shí)間較長(zhǎng)（約 30-60 分鐘），不適合超大量樣本（如 101?以上細(xì)胞）的快速處理。

2. 低速離心沉降法：基于沉降速率的簡(jiǎn)易分離

低速離心沉降法利用活細(xì)胞與死細(xì)胞的沉降速率差異（活細(xì)胞形態(tài)完整、密度均勻，沉降速率較死細(xì)胞更穩(wěn)定），通過(guò)控制離心力與時(shí)間實(shí)現(xiàn)分離，適合對(duì)純度要求不高、樣本量較大的場(chǎng)景（如大規(guī)模 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)）。

操作要點(diǎn)：將細(xì)胞懸液（濃度 1×10?-1×10? cells/mL）置于離心管中，以 50-100×g 低速離心 5-8 分鐘 —— 此時(shí)活細(xì)胞因沉降速率較快，會(huì)部分沉淀于管底，而死細(xì)胞（多為腫脹或破裂狀態(tài)，密度低）多懸浮于上清液中；小心吸取上層 1/3-1/2 上清液丟棄（含大量死細(xì)胞），保留管底活細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基重懸后即可。若需提高純度，可重復(fù)操作 1-2 次，但需注意每次離心后活細(xì)胞回收率會(huì)下降 5%-10%。

優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是操作極簡(jiǎn)便（無(wú)需特殊試劑）、耗時(shí)短（10-20 分鐘）、成本低，適合應(yīng)急處理；缺點(diǎn)是純度較低（死細(xì)胞去除率僅 60%-70%），易因離心力過(guò)高導(dǎo)致活細(xì)胞沉淀不完全或損傷，需提前通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳離心參數(shù)。

3. 過(guò)濾法：基于體積差異的快速篩選

過(guò)濾法利用活細(xì)胞與死細(xì)胞（及碎片）的體積差異，通過(guò)特定孔徑的濾膜過(guò)濾細(xì)胞懸液，截留活細(xì)胞、去除小分子死細(xì)胞碎片，適合死細(xì)胞以碎片形式存在的場(chǎng)景（如細(xì)胞培養(yǎng)后期、凍融復(fù)蘇后）。

操作要點(diǎn)：選擇孔徑略小于活細(xì)胞直徑的濾膜（如淋巴細(xì)胞直徑約 8-10μm，選 7μm 濾膜；腫瘤懸浮細(xì)胞直徑約 12-15μm，選 10μm 濾膜），濾膜材質(zhì)優(yōu)先選用親水性聚醚砜（PES）或尼龍，避免疏水性材質(zhì)吸附細(xì)胞；將濾膜安裝于過(guò)濾漏斗，用少量新鮮培養(yǎng)基濕潤(rùn)濾膜后，緩慢加入細(xì)胞懸液（流速＜1mL/min，避免壓力過(guò)大損傷細(xì)胞），待過(guò)濾完成后，用 5-10mL 培養(yǎng)基沖洗濾膜 2-3 次，收集濾膜上截留的活細(xì)胞。

優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是快速（5-10 分鐘）、可處理大量樣本，適合去除死細(xì)胞碎片；缺點(diǎn)是無(wú)法分離完整死細(xì)胞（若死細(xì)胞體積與活細(xì)胞接近），且濾膜可能吸附部分活細(xì)胞（吸附率通常＜5%），需提前檢測(cè)濾膜對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的吸附性。

二、基于分子標(biāo)志物的死細(xì)胞去除技術(shù)：高純度分選的精準(zhǔn)方案

當(dāng)實(shí)驗(yàn)對(duì)活細(xì)胞純度要求極高（如單細(xì)胞測(cè)序、細(xì)胞移植）時(shí)，需基于活細(xì)胞與死細(xì)胞的分子標(biāo)志物差異（如細(xì)胞膜完整性、表面抗原）進(jìn)行分選，核心技術(shù)包括免疫磁珠分選法與流式細(xì)胞術(shù)分選法。

1. 免疫磁珠分選法：基于細(xì)胞膜完整性的靶向去除

免疫磁珠分選法利用 “死細(xì)胞細(xì)胞膜破損，暴露胞內(nèi)抗原（如磷脂酰絲氨酸外翻、DNA 片段）” 的特性，通過(guò)偶聯(lián)特異性抗體的磁珠結(jié)合死細(xì)胞，再利用磁場(chǎng)分離死細(xì)胞與活細(xì)胞。

操作要點(diǎn)：常用靶向死細(xì)胞的抗體包括抗磷脂酰絲氨酸（Annexin V）抗體（死細(xì)胞早期膜外翻標(biāo)志物）、抗單鏈 DNA（ssDNA）抗體（死細(xì)胞 DNA 降解標(biāo)志物）；將細(xì)胞懸液與磁珠（如 10μL 磁珠 / 1×10? cells）在 4℃避光孵育 10-15 分鐘，期間輕柔混勻，避免磁珠聚集；將孵育后的細(xì)胞懸液加入磁場(chǎng)分離柱，死細(xì)胞因結(jié)合磁珠被截留于柱內(nèi)，活細(xì)胞隨洗脫液流出，收集洗脫液即可獲得高純度活細(xì)胞。

優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是純度極高（死細(xì)胞去除率＞98%）、特異性強(qiáng)，可同時(shí)去除完整死細(xì)胞與碎片；缺點(diǎn)是成本高（磁珠價(jià)格昂貴）、操作需嚴(yán)格控制溫度與孵育時(shí)間（避免抗體非特異性結(jié)合），適合小樣本（1×10?-1×10? cells）的高純度分選。

2. 流式細(xì)胞術(shù)分選法：多參數(shù)篩選的極致精準(zhǔn)

流式細(xì)胞術(shù)分選法通過(guò)熒光染料標(biāo)記死細(xì)胞，結(jié)合流式細(xì)胞儀的多參數(shù)檢測(cè)（熒光信號(hào)、散射光信號(hào)），精準(zhǔn)識(shí)別并分選活細(xì)胞，適合對(duì)細(xì)胞純度與活性要求極高的實(shí)驗(yàn)（如干細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞功能檢測(cè)）。

操作要點(diǎn)：常用死細(xì)胞熒光染料包括臺(tái)盼藍(lán)（無(wú)法進(jìn)入活細(xì)胞，死細(xì)胞呈藍(lán)色）、PI（碘化丙啶，僅進(jìn)入死細(xì)胞與 DNA 結(jié)合，激發(fā)后發(fā)紅色熒光）、7-AAD（死細(xì)胞特異性染料，發(fā)紅色熒光，對(duì)活細(xì)胞毒性更低）；將細(xì)胞懸液與熒光染料（如 PI 終濃度 5μg/mL）在室溫避光孵育 5-10 分鐘，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè) —— 活細(xì)胞因無(wú)熒光信號(hào)、散射光信號(hào)穩(wěn)定（形態(tài)完整）被識(shí)別，死細(xì)胞因熒光陽(yáng)性被排除，通過(guò)分選模塊收集活細(xì)胞，分選后需用培養(yǎng)基洗滌 1-2 次去除殘留染料。

優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是純度最高（活細(xì)胞純度可達(dá) 99% 以上）、可同時(shí)分析細(xì)胞活性與表面標(biāo)志物（如分選 CD4?T 活細(xì)胞）；缺點(diǎn)是設(shè)備昂貴（需流式分選儀）、操作復(fù)雜（需專(zhuān)業(yè)人員）、分選速度慢（每小時(shí)約 1×10? cells），且高速分選可能對(duì)活細(xì)胞造成一定損傷（活性下降 5%-10%）。

三、關(guān)鍵操作注意事項(xiàng)與技術(shù)選擇原則

無(wú)論選擇哪種方法，均需注意以下核心要點(diǎn)以保障活細(xì)胞質(zhì)量：

1.無(wú)菌操作：所有試劑（梯度介質(zhì)、磁珠、濾膜）需無(wú)菌處理，操作過(guò)程在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，避免污染；

2.溫和處理：離心時(shí)避免過(guò)高轉(zhuǎn)速（＞500×g），過(guò)濾時(shí)避免壓力過(guò)大，孵育熒光染料或磁珠時(shí)避免劇烈振蕩，減少活細(xì)胞損傷；

3.活性驗(yàn)證：去除死細(xì)胞后，需通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色（活細(xì)胞拒染）或 MTT 法檢測(cè)活細(xì)胞比例，確保活細(xì)胞活性＞90%（常規(guī)實(shí)驗(yàn)）或＞95%（精準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)）。

技術(shù)選擇需遵循 “需求適配” 原則：

常規(guī)培養(yǎng)、樣本量大、成本敏感：優(yōu)先選低速離心沉降法或過(guò)濾法；

常規(guī)實(shí)驗(yàn)、對(duì)純度有要求：選密度梯度離心法；

精準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞移植、蛋白表達(dá)）、小樣本：選免疫磁珠分選法；

極致純度需求（如單細(xì)胞測(cè)序、干細(xì)胞研究）：選流式細(xì)胞術(shù)分選法。

懸浮細(xì)胞中死細(xì)胞的有效去除，是保障細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定性與實(shí)驗(yàn)可靠性的基礎(chǔ)。不同技術(shù)各有優(yōu)劣，需結(jié)合細(xì)胞類(lèi)型、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c樣本特征靈活選擇，同時(shí)通過(guò)規(guī)范操作減少活細(xì)胞損傷，最終實(shí)現(xiàn) “高效去除死細(xì)胞、最大保留活細(xì)胞活性” 的目標(biāo)，為后續(xù)細(xì)胞功能研究、藥物篩選或產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供高質(zhì)量細(xì)胞原料。