使用Cellspace-3D培養(yǎng)肝癌類器官時，需結(jié)合其微重力模擬、低剪切力及三維培養(yǎng)技術(shù)，通過模擬體內(nèi)微環(huán)境提升類器官的生理相關(guān)性，具體操作及優(yōu)勢如下：
一、技術(shù)原理與操作要點
1.微重力環(huán)境模擬
旋轉(zhuǎn)壁容器（RWV）：通過水平旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)室，使細胞懸浮于培養(yǎng)基中，抵消重力沉降效應，形成近似“自由落體”的微重力環(huán)境。肝癌細胞在此環(huán)境下自發(fā)聚集，形成直徑可達500μm的三維球體，內(nèi)部呈現(xiàn)梯度氧分壓、代謝物濃度及細胞外基質(zhì)（ECM）沉積，更接近體內(nèi)腫瘤組織結(jié)構(gòu)。
隨機定位儀（RPM）：通過多軸隨機旋轉(zhuǎn)分散重力影響，有效重力<0.01g，適合短期實驗（如細胞信號傳導研究）。
2.低剪切力保護
采用層流優(yōu)化與低速旋轉(zhuǎn)（<10 rpm），減少機械應力對細胞的損傷，保護細胞膜及細胞間連接。肝癌細胞在微重力環(huán)境下通過黏附分子（如E-鈣黏蛋白）自發(fā)聚集，形成具有代謝梯度的類器官。
3.三維培養(yǎng)基質(zhì)選擇
水凝膠支架：使用生物降解水凝膠（如Matrigel、膠原）為類器官提供結(jié)構(gòu)支持，促進細胞-ECM相互作用。
3D打印支架：結(jié)合3D打印技術(shù)構(gòu)建定制化支架，模擬腫瘤微環(huán)境中的物理屏障。
二、應用優(yōu)勢
1.腫瘤異質(zhì)性研究
微重力培養(yǎng)的肝癌類器官可模擬實體瘤的異質(zhì)性，包含壞死核心與增殖外層。例如，乳腺癌模型中，微重力環(huán)境下腫瘤細胞對藥物的耐藥性提升3倍，與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標志物表達上調(diào)相關(guān)。
2.藥物篩選與耐藥性評估
在3D肝癌球狀體中測試藥物療效，發(fā)現(xiàn)其滲透深度與患者響應率正相關(guān)，減少傳統(tǒng)二維模型中的假陰性/陽性結(jié)果。例如，PD-1抑制劑在3D模型中的滲透深度可預測患者臨床響應。
3.腫瘤微環(huán)境模擬
通過共培養(yǎng)肝癌細胞與基質(zhì)細胞（如內(nèi)皮細胞、癌相關(guān)成纖維細胞CAFs），模擬腫瘤微環(huán)境中的細胞間相互作用，研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制。
4.個體化醫(yī)療
利用患者來源的肝癌細胞構(gòu)建3D模型，指導術(shù)后藥物選擇，提高治療成功率。例如，高通量篩選評估患者對靶向藥物（如EGFR抑制劑）的敏感性。
三、實驗設(shè)計與挑戰(zhàn)
1.實驗步驟
準備階段：清潔培養(yǎng)室與微載體，配置含生長因子的培養(yǎng)基（如添加EGF、HGF）。
接種與培養(yǎng)：將肝癌細胞懸液與微載體混合，接種至旋轉(zhuǎn)壁容器，調(diào)整旋轉(zhuǎn)速度（5-10 rpm）與溫度（37℃）。
監(jiān)測與調(diào)整：定期監(jiān)測細胞密度、活性及代謝物濃度（如乳酸、葡萄糖），根據(jù)實驗需求調(diào)整氧氣濃度（5% CO?）、pH值（7.2-7.4）等參數(shù)。
2.技術(shù)挑戰(zhàn)與解決方案
營養(yǎng)擴散限制：球體中心區(qū)域易因營養(yǎng)/氧氣不足而壞死。解決方案包括引入微流控灌注系統(tǒng)或聲波操控技術(shù)，實現(xiàn)動態(tài)補充與代謝物清除。
規(guī)?；囵B(yǎng)：傳統(tǒng)RWV單次培養(yǎng)體積<50 mL，難以滿足工業(yè)級需求。開發(fā)模塊化生物反應器陣列（如10×RWV并聯(lián)運行），總培養(yǎng)體積達500 mL，實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
實時監(jiān)測：封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)難以實時獲取細胞狀態(tài)數(shù)據(jù)。集成拉曼光譜（代謝物分析）與電阻抗傳感（細胞密度），實現(xiàn)培養(yǎng)過程閉環(huán)控制。
四、典型案例
1.藥物療效預測
在3D肝癌球狀體中測試索拉非尼（一線靶向藥物）的療效，發(fā)現(xiàn)其滲透深度與患者生存期正相關(guān)，指導臨床用藥方案優(yōu)化。
2.腫瘤轉(zhuǎn)移機制研究
通過共培養(yǎng)肝癌細胞與內(nèi)皮細胞，模擬腫瘤血管生成過程，發(fā)現(xiàn)微重力環(huán)境下腫瘤細胞遷移能力顯著增強，與整合素β1表達上調(diào)相關(guān)。
3.個性化醫(yī)療應用
利用患者來源的肝癌細胞構(gòu)建3D模型，篩選對免疫檢查點抑制劑（如帕博利珠單抗）敏感的患者群體，提高免疫治療成功率。
