腸道類器官培養(yǎng)是一種模擬體內(nèi)腸道環(huán)境，在體外培養(yǎng)腸道干細胞和多能干細胞以形成具有腸道結構和功能的類器官的技術。以下是腸道類器官培養(yǎng)的基本方法：
一、材料準備
1.組織來源：通常來源于人類小腸和結腸的生物組織，這些組織可以是健康的，也可以是腫瘤組織，但必須確保合規(guī)性。
2.試劑與培養(yǎng)基：
70%（V/V）乙醇：用于消毒和清潔。
AdvDMEM+++（或其他適用的培養(yǎng)基）：用于細胞培養(yǎng)。
Primocin（原代細胞抗生素）：用于防止細菌感染。
膠原酶2、Y-27632 RhoⅡ型激酶抑制劑等：用于組織消化和細胞分離。
BME（基質(zhì)膠/基底膜）：為類器官提供支撐和營養(yǎng)。
紅細胞裂解液：用于去除紅細胞。
擴增培養(yǎng)基（含Wnt-3a、Rspo-1、Noggin、EGF等生長因子）：用于促進類器官的生長和分化。
3.耗材：
離心管（15ml和50ml）、培養(yǎng)皿（10cm）、手術刀、封口膜、搖床、細胞過濾器（100μm）、移液管（5ml）、24孔板等。
二、培養(yǎng)步驟
4.1.組織處理：
將組織保存在含有AdvDMEM+++和Primocin的50ml離心管中，4℃保存直至使用。
在生物安全柜中，將工作區(qū)除菌，并處理相關器材。
將組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，并用手術刀切成1立方毫米左右的小塊狀。
2.組織消化：
添加消化培養(yǎng)基（含膠原酶等）并用移液管吹打混勻。
將組織轉(zhuǎn)移到離心管中，用培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)皿以確保組織全部進入離心管。
蓋上離心管蓋子，用封口膜封住，置于搖床上進行消化。
3.細胞分離與重懸：
采用細胞過濾器過濾細胞，并用注射器推桿幫助細胞通過濾網(wǎng)。
離心后棄去上清液，用AdvDMEM+++沖洗細胞并再次離心。
最后一次將細胞用BME重懸。
4.類器官形成：
將適量細胞BME混合液添加在預熱的24孔板中。
將24孔板倒置在37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，使液滴凝固。
小心地在每孔添加擴增培養(yǎng)基和RhoKi。
持續(xù)觀察類器官生長狀態(tài)。
5.傳代培養(yǎng)：
去除類器官培養(yǎng)基，用預冷AdvDMEM+++沖洗類器官并破壞BME液滴。
收集類器官并轉(zhuǎn)移到新的離心管中進行離心。
用BME重懸類器官并重新接種在預熱的培養(yǎng)基中。
置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并定期更換培養(yǎng)基。
三、注意事項
1.無菌操作：整個培養(yǎng)過程必須在無菌條件下進行，以防止細菌和其他微生物的污染。
2.溫度控制：細胞培養(yǎng)箱的溫度應保持在37℃，以模擬體內(nèi)環(huán)境。
3.CO2濃度：細胞培養(yǎng)箱中的CO2濃度應保持在5%，以維持細胞的正常生長和分化。
4.定期觀察：應定期觀察類器官的生長狀態(tài)，及時發(fā)現(xiàn)并處理污染或異常情況。
5.質(zhì)量控制：對類器官進行質(zhì)量控制，包括生長活力評估、細胞懸液數(shù)量評估、單細胞懸液活力評估以及免疫學標記物的表達評估等。
通過以上步驟，可以在體外成功培養(yǎng)出具有腸道結構和功能的類器官，為腸道疾病的研究和治療提供有力的工具。
